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东富龙之关于层析柱柱效的那些事

前    言
       在目前的生物制药行业,绝大多数的分离纯化,都会应用到层析技术,当然目前化药、中药提取、化妆品、甚至食品行业也会应用到层析技术。涉及到层析技术就涉及硬件设备装填介质后应用于生产,但可用于生产的前提或者说是标准,需要一个衡量指标来衡量装柱效果,这个衡量标准就是我们本文要提到的“柱效”,当然不止柱效一个参数,还包括对称性,拖尾因子等。这些参数都将在测量柱效时一同处理。
       理论塔板数N,色谱的柱效参数之一,(简称柱效)。N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
       测量柱效需尽量满足理论条件,才可更接近实际值。

  柱效测定的理论基础
柱效的计算公式:
理论塔板数N=5.54×(t/W1/2)2
对称性Af=b/a  
其中:
N:       当前柱高的理论塔板数
t:    保留时间
W1/2:    半峰宽
Af:    对称性
a:       延时间轴正向10%峰高处至100%峰高处时间
b:     延时间轴正向100%峰高处至10%峰高处时间

备注:通常有时还会有拖尾因子,实际生产时用的不多,对于一些检验用的层析柱
会要求拖尾因子在1-1.05,拖尾因子的计算方式时5%峰高处的a和b的比值。
当峰型符合正态分布时,采用该计算方式。





      理论塔板数:根据填料颗粒粒径大小计算,在当前柱高的理论高度中,竖向堆积填料颗粒的理论数量。
      实际计算柱效为理论塔板数的1/2-1/3左右,没有特殊说明默认为1米条件下。

             例如:DEAE 90um填料的理论塔板数应为
                       1m/90um=11111.11
                       11111.11×(1/2-1/3)=5555-3700

       所以实际柱效的理论值在3700-5555左右,实际值还会偏低一般在3000-5000左右,有时甚至更低。
       备注:通常DEAE用于生产时,并不看重柱效,实际2000左右时也会用于生产,除非是柱效对生产的结果影响较大时,会考虑柱效,并且高柱效并不是每次都可装填出,设定标准是不建议定过高,避免影响生产。
       柱效:从名字上理解是层析柱的分离效果。层析柱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低,色谱柱的柱效越好,类似于每个塔板的分离效率相同,有效塔板数越多,最终得到的物质越纯。柱效率是指溶质通过色谱柱之后其区域宽度增加了多少,它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关,这是所谓色谱的动力学过程。根据塔板理论,可以计算一根色谱柱所达到的理论塔板数,或表达为每米理论塔板数n/m。显然,N值越大,或H值越小,柱效越高。分散效果主要取决于所选择的固定相。

测量柱效的方法

       前期准备:
                       准备好测试溶剂及测试样品
                       具备紫外检测器或电导率检测器的层析系统
                       样品至进入柱内及从流动相出口至检测器管路越短越好

       配置溶液:
                       目前绝大多数的测量样品溶液,通常选用1%柱体积(以下简称CV)上样量,1%的浓度(当柱直径大于1000mm以上时包括1000mm可考虑2%的浓度,减少因管路过大而对样品产生的稀释)。

       样品溶液及流动相溶液的选择通常选用条件为:
● 填料耐受
● 设备耐受
● 填料不吸附
● 无作用力或作用力最小
● 黏度低

         填料耐受:所使用溶液不会破坏填料的结构及框架,否则高附加值的填料将浪费。
         设备耐受:所使用溶液同样需被硬件设备耐受,以免破坏设备及影响测量结果。
         填料不吸附:使用溶液如含有填料可吸附物质,将影响柱效,所测量值偏离正常结果,或无法洗脱。
         无作用力或作用力小:尽量选择和填料间无作用力或作用力低的溶液,减少影响因素,追求接近理论值。
         粘度低:黏度高的溶液会使运行时压力过大,并且可能造成拖尾现象。

         下面列出目前通用的,主流的柱效测试溶液选择:
         低压填料(绝大多数软胶,耐受3bar压力)



90μm粒径DEAE 


34μm粒径S100

通常有两种方式:
       丙酮法:用纯化水做流动相平衡2CV以上,并且将紫外检测器波长设定为254nm或280nm,并且平衡时基线稳定,1%丙酮做样品做测试。
       NaCl法:以0.4MNaCl平衡2CV以上,并且电导率曲线趋于平稳,最好柱前与柱后都有电导率检测器,前后一致及稳定后,2MNaCl上样,测量柱效相对最好,但由于层析设备及层析柱绝大多数的不锈钢材质都为316L,而316L不锈钢对氯离子耐受能力为在2MNaCl下,25℃,可耐受1小时,处于耐受问题可选择0.8MNaCl上样或1.0MNaCl上样。此方发较丙酮法的优点为NaCl更环保,不考虑有机溶剂处理及残留的问题。缺点为必须平衡稳定后才可测量柱效,否则峰形不稳定。此方法测量的柱效/对称性较丙酮偏低,物料损耗大。

B. 高压填料(基本为反相填料)

通常有两种方式:
● 萘-乙腈法:用100%乙腈做流动相平衡2CV以上,并且紫外在254nm处基线稳定,1%萘-乙腈溶液做样品测试。
● 甲苯-乙腈法:用50%乙腈-水溶液做流动相平衡2CV以上,并且紫外在254nm处基线稳定,1%甲苯50%乙腈-水溶液做样品测试。
上文说到的填料不耐受在此处有体现,大多数反相填料,无法耐受纯水相,纯水相会导致填料功能基团失效。

C.其他
 由于市面上的填料厂家过多,A与B中目前为主流测试方法,其他需根据填料生产厂家提供的测试方法。


量柱效的结果分析

1、峰型:




标准峰:符合正态分布可正常计算柱效,大多数峰均可计算柱效查看装柱状态是否良好,但双峰或者多峰就无计算的必要,需查找原因重新测定或者重新装柱。
● 骆驼峰:当前样品出现两次峰型,主要原因一般为填料在层析柱内部断层,不均一,一般是由于装柱时进气,或者二次压柱导致填料出现断层。另一原因主要为填料过脏(主要为上层)或者柱头有堵塞的情况。出现以上情况都需处理后,重新装柱
● 拖尾峰与前倾峰:当Af>1时,我们称作拖尾,拖尾为柱床压的过松,当Af<1时我们称作前倾,前倾为柱床压的过紧。通常在0.9-1.3的范围内我们认为良好对称性,对于部分要去不高的甚至卡到0.8-1.5,就可满足生产(因有时为第一步粗纯,较好的对称性的柱效有时效果不明显(主要还是考虑到实际生产的便捷性),但总体上的效果还是柱效越高,对称性越接近于1,效果越好。
● 矮胖峰:通常的主要原因为样品进入柱子时被稀释,选择柱子进口上样,如还存在问题,需重新装柱,再次测量柱效。
● 毛刺峰:通常的主要原因为有细小气泡伴随样品出现,排气泡后再次测量,如效果不达标,需重新装柱,装柱过程中注意提前排气泡,对填料进行更好的匀浆,将填料内部气泡尽量排出。
● 漂移峰:通常的主要原因为为平衡好,基线不稳,重新平衡,平衡稳定后,再次测量柱效,结果不合格时重新装柱。
● 阶梯峰:通常的主要原因为有残留死体积大导致,可能是由于密封圈使用错误导致,检查密封圈使用的是否正确,并检查是否有加大死体积部位,后重新测量,如结果不合格需重新装柱。

2、出图分析:
通常分析图谱会基于两个参数:
柱效与对称性
● 柱效:柱效已经在上文中提过,计算方式基本通用于99%以上的填料,此方法计算的为大概数据,通常柱效会比计算值偏低,主要是由于填料粒径的均一度,还有功能基团的大小所影响,导致实际测量效果会更低。
根据笔者的经验之谈,大多数DEAE柱效在3000左右时,就可以满足生产,但也有药品的生产需求高柱效。
● 对称性:通常填料供应商给出的对称性很宽泛,一般在0.8-1.8均认为合格,在早期的生产中,绝大多数也认为可行,但随着行业发展目前对对称性的要求越来越高,以目前的状况来看对称性在0.9-1.3之间,在生产上普遍认为可接受,在个别生产中要求在1.2以内,甚至1.1左右,这是对于生产来说,对于检验用的预装色谱柱会要求在1.0左右,并且要求拖尾因子在1.0-1.05。
还有一点比较重要,就是不同供应商设备测量的柱效不一致,据笔者了解,差异很大,如实际用时,可采用手动作图来验证数据差异。
另外,装柱时的压力,流速,匀浆比,压缩比需确定,这几项参数对装柱结果影响巨大,同时这些参数也需要根据填料的具体使用状况做细微的变动。如填料使用多次后,有时需加大压缩比来保证对称性。


柱效测定实例







丙酮法测量90um填料柱效


NaCl法测试90um填料柱效


备注:两者不是同一次装柱测量   
       图中的两次为东富龙海崴的层析系统及层析柱实际装柱测量的柱效,层析系统为20L/min流速的梯度层析系统,层析柱为ID600mm x 600mm自动低压层析柱,两图的测量结果均满足可实际生产的标准。
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